Вторник, 09 апреля 2013 19:23

Определение белка по методу Къельдаля

opredelenie-belka-po-metodu-k'eldalyaОдним из важнейших показателей качества продукции, определяющим ее пищевую ценность, является содержания белка. Классическим способом определения белка является метод, разработанный еще в 1883 году датским химиком Иоганном Кьельдалем, который впоследствии был назван его именем. Это очень трудоемкий и продолжительный анализ, и потому в современной лабораторной практике метод Кьельдаля часто пытаются заменить альтернативными методами определения белка, в том числе, с использованием дорогостоящих программно-аппаратных комплексов. Но метод Кьельдаля, несмотря на его сложность, до сих пор остается единственным общепризнанным арбитражным методом определения белка, и чаще всего используется в качестве эталонного для калибровки и настройки других методик анализа сырья и готовой продукции.

Почему же методу Къельдаля, не смотря на более чем 120-летнюю историю, до сих пор не найдено достойной альтернативы? Причиной тому - высокая специфичность выбранной реакции окисления белка серной кислотой, в результате которой разрушаются пептидные связи в его молекуле и образуются ионы аммония, которые в последующем и могут быть легко проанализированы стандартными методами. Однако воспроизводимость и точность метода Кьельдаля в существенной степени зависит от опыта аналитика. Стремясь свести к минимуму влияние человеческого фактора на результаты анализа, ускорить выполнение методики и повысить ее безопасность, ведущие производители аналитического оборудования разработали специализированные комплекты оборудования для анализа по методу Кьельдаля. Метод включает в себя несколько основных этапов: отбор и подготовку проб, мокрое озоление, отгонку с паром и определение концентрации аммония (фотометрически или титриметрически). Для каждого этапа предусмотрены свои аппаратные решения, которые в настоящее время фактически стали стандартом де-факто и практически полностью заменили действия, выполняемые лаборантом вручную.

Этап 1. Отбор и подготовка проб. Необходимое условие получения точных результатов анализа по Кьельдалю - тщательная подготовка образцов. Процедура подготовки проб должна обеспечивать гомогенизацию образца, т. к. размер частиц в анализируемых пробах не должен превышать 1 мм. Взвешивание образцов для последующего анализа по Къельдалю должно проводиться на аналитических весах с точностью до 0,1 мг. Важно знать влажность образца и всегда анализировать либо предварительно высушенные образцы, либо образцы с точно установленным содержанием влаги.

Этап 2. Мокрое озоление. Самым трудоемким и продолжительным этапом в методе Кьельдаля является стадия мокрого озоления, в результате которого происходит полное "сжигание" образца в серной кислоте. Однако использовать для озоления чистую серную кислоту нецелесообразно из-за низкой скорости протекания процесса. Скорость озоления и разрушения образца зависят не только от свойств кислоты, но и от температуры обработки. Чем выше температура, тем меньше времени уходит на разложение. При использовании чистой серной кислоты температура озоления ограничивается, в основном, её точкой кипения (338°С), в то время как для полного разложения необходима более высокая температуры. Скорость мокрого озоления можно значительно увеличить за счет добавления солей и катализаторов. В классическом приборе Кьельдаля на каждый грамм образца обычно необходимо 25 мл кислоты и несколько часов для проведения разложения. Основной эксплуатационной проблемой для данной стадии анализа является выделение большого количества ядовитых паров диоксида и триоксида серы.

Этап 3. Отгонка с паром. Полученный после стадии разложения прозрачный раствор не годится для непосредственного определения в нем аммонийного азота из большого содержания мешающих компонентов. Для отделения аммонийного азота он переводится в аммиачную форму (добавлением щелочи) и отгоняется с паром на специальных приборах, называемых дистилляторами.

Этап 4. Определения содержания аммонийного азота. Результаты по определению белка принято представлять в мг/л аммонийного азота, поэтому метод определения белка по Кьельдалю (что более распространено в пищевой промышленности) часто еще называют методом определения общего азота по Кьельдалю (используется, например, в экологическом анализе). Пересчет на содержание белка осуществляется по известному коэффициенту, который в общем случае равен 6.25, но может несколько отличаться для различных типов белка. Перегоняемый с паром аммиак собирается в колбе, в которую предварительно помещают раствор борной или серной кислоты с известной нормальностью. Полученный чистый раствор бората или сульфата аммония может быть легко оттитрован прямым или обратным методом.

В рамках этой статьи вполне осознано не рассматривались другие методики определения белка, поскольку все они вторичны и требуют калибровки по методу Кьельдаля. Несмотря на кажущуюся сложность комплекса оборудования для определения белка по Кьельдалю, использование именного этого метода анализа гарантирует достоверность результатов, в то время как предложенное приборное решение позволяет существенно увеличить воспроизводимость, снизить расход реактивов и обеспечить безопасность персонала. Специалистами ФГБУ ЦНПВРЛ проводится определение белка по методу Къельдаля в пищевых продуктах и кормах с помощью автоматической установки для разложения KJELDATHERM GERHARDT и автоматической установки для перегонки с водяным паром VAPODEST-20 GERHARDT.